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刘瑾教授团队揭示CRISPR吊秤

吊秤    
2020年12月02日

近日,美国University of North Texas Health Science Center刘瑾教授课题组与合作者在eLife上发表题为:Structural and functional insights into the bona fide catalytic state of Streptococcus pyogenes Cas9 HNH nuclease domain 的论文。该研究结果以Short Reports形式在线发表,并被编辑选入eLife digests。通过综合运用各种计算模拟方法和体外以及基于细胞的功能实验,作者从原子和分子水平上揭示并验证了SpyCas9 HNH核酸酶结构剪切靶DNA链的催化构象。

研究表明SpyCas9 HNH结构域“停靠”到靶DNA链可采取两种不同构象状态中的一种。基于N863在HNH结构域ββα催化元件上的不同取向,作者将两种构象分别称为N863-OUT和N863-IN。N863-OUT构象见于先前报道之中,但实际上并不具有剪切能力。当转变为N863-IN构象状态时,HNH结构域能够巧妙地利用D839-H840-N863三残基组合行使剪切靶DNA链的功能。进一步的分子动力学模拟和自由能计算表明N863-OUT比N863-IN状态更为稳定,这解释了为什么实验结构常常捕获到前者构象状态。

几乎在同期,来自美国和加拿大的课题组运用冷冻电镜技术获得了Cas9 RNP结合DNA所形成的处于不同剪切阶段的复合物结构。这些结构分别对应构象校验点(conformational checkpoint)状态(先前其它课题组已经报道过)、剪切后(post-cleavage)状态、以及产物(product)状态。

他们的研究结果于7月8日在线发表在Nature Structural &Molecular Biology上,题:Cryo-EM structures reveal coordinateddomain motions that govern DNA cleavage by Cas9。该研究同样表明SpyCas9利用D839-H840-N863三残基催化靶DNA水解,尽管并没有辅以功能实验进行验证。

总之,这两项独立工作相互补充,互相验证,从不同角度和不同层次上清楚地展示了SpyCas9 HNH核酸酶结构剪切靶DNA链的活性构象,消除了先前对HNH结构域在结构-功能关系认识上的分歧。所获得的新的结构信息将有助于合理优化SpyCas9的靶向特异性和催化活性。据了解,Dr. Jin Liu组据此已经设计出若干种新型突变体蛋白,初步实验表明它们在不同程度上降低了脱靶效应,后续工作正在进展之中。

据悉,上海工程技术大学化学与化工学院左志成副教授为论文的第一作者,University of North Texas Health Science Center药学院Dr. Jin Liu和Dr. Yu-Chieh Wang为论文的共同通讯作者。另外,美国University of Oklahoma Dr.Rakhi Rajan课题组在论文修改的过程提供了额外的实验支持。

研究背景

CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌抵抗外源遗传物质感染而演化出的一种获得性防御机制。CRISPR全称Clustered Regularly InterspacedShort Palindromic Repeats,翻译为规律成簇的间隔短回文重复序列;Cas指的是CRISPR关联(CRISPR-associated)蛋白。当病毒或外源质料侵入时,细菌通过将这些外源DNA整合到自身基因组而产生免疫“记忆”;当再次遭受入侵时,细菌CRISPR-Cas系统可以特异性地识别出相应的外源DNA,将它们切断,沉默外源基因的表达。正是由于这种精准的靶向特性,CRISPR/Cas系统业已被改造成一种强大的基因组编辑和调控工具。目前已经鉴别出多种类别的CRISPR/Ca(Type I-VI)系统,其中II型CRISPR/Cas9系统的研究最为深入,得到了诸多方面的应用。CRISPR/Cas9是继锌指核酸内切酶(ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)之后的第三代基因组编辑技术。凭借操作方便、成本低廉、靶向高效等优势,CRISPR/Cas9技术迅速风靡基因编辑领域,有望为治疗一些人类重大遗传疾病及癌症带来希望。

核酸内切酶Cas9是II型CRISPR系统的基因“剪刀手”,它通过与引导RNA(gRNA)形成核糖核蛋白复合物(RNP)而发挥靶向和剪切功能。仅仅通过改变引导RNA的前20个核苷酸序列,原则上Cas9 RNP就可以选择性识别并作用于任何基因位点。2012年,Jennifer Doudna和 Emmanuelle Charpentier研究团队在Science上首次报道了化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9(记为SpCas9或SpyCas9)在体外具有剪切DNA的活性。根据Google Scholar统计显示,截止2019年8月,该研究论文已经被引用近7300次(Doudna和Charpentier因此成为诺奖热门人选)。尽管来自其它物种的Cas9蛋白相继被鉴别出来,基于SpyCas9开发的基因编辑工具目前在全球生物实验室和生物技术公司中仍然受到最为广泛的应用,这在一定程度上得益于对该蛋白结构与功能机理的持续解析。

Cas9包含两个称之为HNH和RuvC的核酸酶结构域,其活性依赖于镁离子。这两个结构域好比两把剪刀,分别将DNA两条链剪开,从而形成双链缺口。HNH负责切割与RNA引导序列互补的DNA链(即靶DNA链),另一条被置换的DNA链(即非靶DNA链)则由RuvC完成剪切。就SpyCas9而言,处于不同构象状态的结构相继被解析出来,包括无核酸结合的apo态、仅结合引导RNA的状态、结合非完整DNA的状态及结合R-loop的状态。RuvC剪切非靶DNA链的活性构象及相关催化机理基本被简明。相比之下,HNH与靶DNA链形成的活性构象及参与催化的关键残基仍然存在很大的争议。其中,H840作为广义碱(general base)的功能已经得到证实。此外,生化实验表明N863也对剪切靶DNA链至关重要。但令人十分费解的是,在所有通过结构或计算手段获得的处于结合状态的SpyCas9结构中,残基N863明显位于HNH活性中心之外,与之毗邻的D861却朝向靶DNA链剪切位点。如果仅从结构上推断,D861似乎是一个关键残基,但缺乏实验支持。除此之外,其它报道的可能直接参与催化的残基有D837,D839和N854。因此,解析SpyCas9与靶DNA形成的处于剪切状态的复合物结构无疑将有助于阐释这些看似矛盾的结构与功能数据。

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